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熒光顯微鏡的工作原理

更新時(shí)間:2020-12-30      點(diǎn)擊次數(shù):2804
光源
多用采200W的超高壓汞燈作光源,它是用石英玻璃制作,中間呈球形,內(nèi)充一定數(shù)量的汞,工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電,引起水銀蒸發(fā),球內(nèi)氣壓迅速升高,當(dāng)水銀*蒸發(fā)時(shí),可達(dá)50~70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,這一過(guò)程一般約需5~15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光,足以激發(fā)各類(lèi)熒光物質(zhì),因此,為熒光顯微鏡普遍采用。
燈室必須有良好的散熱條件,工作環(huán)境溫度不宜太高。新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃,使用一些時(shí)間后,則需要高壓?jiǎn)?dòng)(約為15000V),啟動(dòng)后,維持工作電壓一般為50~60V,工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命,在每次使用2h的情況下約為200h,開(kāi)動(dòng)一次工作時(shí)間愈短,則壽命愈短,如開(kāi)一次只工作20min,則壽命降低50%。因此,使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過(guò)程中,其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極,一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高,紫外線強(qiáng)烈,因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃,以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸。
超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng),燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,前面安裝有集光透鏡。

濾色系統(tǒng)

濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位,由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號(hào),各廠家名稱(chēng)常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名,前面字母代表色調(diào),后面字母代表玻璃,數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。
1.激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn),可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板,提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò),阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。常用型號(hào)為UG-1或UG-5,外加一塊BG-38,以除去紅色尾波。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300~450nm范圍內(nèi)的光通過(guò)。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3,外加BG-38。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350~490nm的光通過(guò)。常用型號(hào)為QB24(BG12)。
開(kāi)始采用金屬膜干涉濾板,由于針對(duì)性強(qiáng),波長(zhǎng)適當(dāng),因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板,均比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。
2.壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過(guò),提供相應(yīng)波長(zhǎng)范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng),常用以下3種壓制濾板:
紫外光壓制濾板:可通過(guò)可見(jiàn)光、阻擋紫外光通過(guò)。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍(lán)光壓制濾板:能通過(guò)510nm以上波長(zhǎng)的光(綠到紅),能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板:能通過(guò)460nm以上波長(zhǎng)的光(藍(lán)到紅),可與BG-3組合,常用OG-11K470AK 490,K510。

反光鏡

其反光層一般是鍍鋁的,因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見(jiàn)光的藍(lán)紫區(qū)吸收少,反射達(dá)90%以上,而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。

聚光鏡

專(zhuān)為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器和暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。
1.明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器,它具有聚光力強(qiáng),使用方便,特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。
2.暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡,因而除散射光外,激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡,可以使用薄的激發(fā)濾板,增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度,壓制濾板也可以很薄,因紫外光激發(fā)時(shí),可用無(wú)色濾板(不透過(guò)紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度,提高了圖像的質(zhì)量,觀察舒適,可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。
3.相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用,可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察,既能看到熒光圖像,又能看到相差圖像,有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

物鏡

各種物鏡均可應(yīng)用。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比,而與其放大倍數(shù)成反比,所以為了提高熒光圖像的亮度,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,配合以盡可能低的目鏡(4×,5×,6.3×等)。

目鏡

在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡,如5×和6.3×。過(guò)去多用單筒目鏡,因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上,但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡,觀察很方便。

落射光裝置

新型的落射光裝置是從光源來(lái)的光射到干涉分光濾鏡后,波長(zhǎng)短的部分(紫外和紫藍(lán))由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射,當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45。傾斜時(shí),則垂直射向物鏡,經(jīng)物鏡射向標(biāo)本,使標(biāo)本受到激發(fā),這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí),濾長(zhǎng)長(zhǎng)的部分(綠、黃、紅等),對(duì)濾鏡是可透的,因此,不向物鏡方向反射,濾鏡起了激發(fā)濾板作用,由于標(biāo)本的熒光處在可見(jiàn)光長(zhǎng)波區(qū),可透過(guò)濾鏡而到達(dá)目鏡觀察,熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高,在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外,更適用于不透明及半透明標(biāo)本,如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。
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